Diagnostik, Leistungsspektrum

Next Generation Sequencing (NGS)

Zur Diagnostik bei unterschiedlichen erblichen Krebserkrankungen wird in den letzten Jahren verstärkt das neuere Verfahren des “Next Generation Sequencing (NGS)” – auch Hochdurchsatzsequenzierung genannt – durchgeführt.

Dies stellt eine effiziente Methode zur gezielten bzw. parallelen Sequenzierung von Genen dar, die mit einem bestimmten Krankheitsbild assoziiert sind. Solche krankheitsassoziierten Gene werden dazu durch spezielle Verfahren angereichert („TruSeq Custom Amplicon Library Preparation (TSCA) sowie „Nextera Rapid Capture Custom Enrichment (beides Illumina)”) und dann auf einer Hochdurchsatzplattform sequenziert („MiSeq (Illumina)“ (s. Titelbild).

TSCA – ein Re-Sequencing-Ansatz – erlaubt es, frei wählbare Zielregionen im humanen Genom von bis zu 600 Kb mit maximal 1.536 Amplikons in einem einzigen Ansatz zu sequenzieren. Dieses Verfahren eignet sich für Aufträge mit einem geringeren Sequenzierbedarf. Weitere Gene können dem Assay nicht einfach hinzugefügt werden. Die Anreicherung der genannten Zielregionen / Gene erfolgt über Oligonukleotidsonden, die eine Länge zwischen 22 und 30 bp haben.

Nextera – ein Enrichment-Ansatz – bei dem von ca. 500 kb bis zu 15 Mbps (1 Mbp ≙ 1,000,000 bp) ebenfalls frei wählbar angereichert werden können – eignet sich für größere Sequenzierprojekte. Außerdem ist dieses Assay nach Bedarf frei erweiterbar.

Durch die Verwendung von Indices könnten bei beiden Methoden bis zu 96 Patientenproben parallel sequenziert werden. Die Produkte werden dann im Anschluß Paired-end, d. h. vom 3´- und vom 5´-Ende her sequenziert. Diese sog. Festphasen-Sequenzierung findet an einer Glasoberfläche – der Flow Cell – statt (Abb. 2).

Abb. 2: Flow Cell

Abb. 2: Flow Cell

Auf der Oberfläche der Flow Cell befindet sich ein hochdichtes Array aus kovalent gebundenen Oligos an die die Library binden kann (Abb. 3):

Abb. 3: Schematische Darstellung der Bindung von definierten DNA-Abschnitten (Library) an die Glasoberfläche

Abb. 3: Schematische Darstellung der Bindung von definierten DNA-Abschnitten (Library) an die Glasoberfläche

Es folgt die sog. ´Bridge Amplification´, die zu zufällig verteilten klonal amplifizierten Clustern auf der Glasoberfläche der Flow Cell führt (Abb.4).

Abb. 4

Abb. 4

Eine Clusterdichte von einer Mio. Cluster pro Quadratmillimeter Glasoberfläche ist für dieses Assay als ideal anzusehen. In einem weiteren Schritt findet dann die eigentliche Sequenzierung statt. Die Rohdaten der Sequenzierung werden danach der Datenauswertung zugeführt.

Mit der Implementierung von NGS kann die Gemeinschaftspraxis für Humangenetik & Genetische Labore nun auch komplexe Fragestellungen des klinischen Alltags beantworten.

Anm.: Der Einheitliche Bewertungsmaßstab (EBM) sieht ab dem 01.07.2016 eigene Ziffern für die Abrechnung des Next-Generation Sequencing vor.
Dr. rer. nat. Christian Kähler

Dr. rer. nat. Christian Kähler