Analyten Molekulargenetik

Next Generation Sequencing (NGS)

OMIM:
Diagnostik:

Next Generation Sequencing (NGS)

Material:

2 ml EDTA-Blut

Analysezeit: 6 - 8 Wochen
Formulare:  

Zur Diagnostik bei unterschiedlichen erblichen Krebserkrankungen wird in den letzten Jahren verstärkt das neuere Verfahren des “Next Generation Sequencing (NGS)” – auch Hochdurchsatzsequenzierung genannt – durchgeführt.

Dies stellt eine effiziente Methode zur gezielten bzw. parallelen Sequenzierung von Genen dar, die mit einem bestimmten Krankheitsbild assoziiert sind. Solche krankheitsassoziierten Gene werden dazu durch ein spezielles Verfahren angereichert (s. „TruSeq Custom Amplicon Library Preparation (TSCA) (Illumina)”) und dann auf einer Hochdurchsatzplattform sequenziert („MiSeq (Illumina)“ (s. Titelbild).

Die Methode – ein Re-Sequencing-Ansatz – erlaubt es, frei wählbare Zielregionen im humanen Genom von bis zu 600 Kb mit maximal 1.536 Amplikons in einem einzigen Ansatz zu sequenzieren. Die Anreicherung der genannten Zielregionen / Gene erfolgt über Oligonukleotidsonden, die eine Länge zwischen 22 und 30 bp haben. Durch die Verwendung von Indices könnten bei dieser Methode bis zu 96 Patientenproben parallel sequenziert werden. Die Produkte werden dann im Anschluß Paired-end, d. h. vom 3´- und vom 5´-Ende her sequenziert. Diese sog. Festphasen-Sequenzierung findet an einer Glasoberfläche – der Flow Cell – statt (Abb. 2).

Abb. 2: Flow Cell

Abb. 2: Flow Cell

Auf der Oberfläche der Flow Cell befindet sich ein hochdichtes Array aus kovalent gebundenen Oligos an die die Library binden kann (Abb. 3):

Abb. 3: Schematische Darstellung der Bindung von definierten DNA-Abschnitten (Library) an die Glasoberfläche

Abb. 3: Schematische Darstellung der Bindung von definierten DNA-Abschnitten (Library) an die Glasoberfläche

Es folgt die sog. ´Bridge Amplification´, die zu zufällig verteilten klonal amplifizierten Clustern auf der Glasoberfläche der Flow Cell führt (Abb.4).

Abb. 4

Abb. 4

Eine Clusterdichte von einer Mio. Cluster pro Quadratmillimeter Glasoberfläche ist für dieses Assay als ideal anzusehen. In einem weiteren Schritt findet dann die eigentliche Sequenzierung statt. Die Rohdaten der Sequenzierung werden danach der Datenauswertung zugeführt.

Mit der Implementierung von NGS kann das Labor für molekulare Medizin nun auch komplexe Fragestellungen des klinischen Alltags beantworten.

Anm.: Der Einheitliche Bewertungsmaßstab (EBM) sieht z. Z. keine eigene Ziffer für die Abrechnung des Next Generation Sequencing vor.

Dr. rer. nat. Christian Kähler

Ansprechpartner: Dr. rer. nat. Christian Kähler

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